MATERIA£Y

Zwierzeta eksperymentalne
Badania przeprowadzono na szczurach p³ci mêskiej rasy Buffalo w wieku trzech miesiecy wa¿acych od 130 - 150 g. Zwierzêta pochodzi³y z hodowli Katedry i Zak³adu Anatomii patplogicznej Akademii Medycznej we Wroc³awiu. W czasie badañ zwierzêta  otrzymywa³y standardow¹ pasze granulowan¹ Murigan (Zak³ad Pasz Treœciwych w Motyczu k/Lublina) oraz wodê z sieci miejskiej ad libidum. 
Odczynniki specjalne
Amersham (USA)
-odczynnik Boltona - Huntera

BDH Ceemicals Ltd. (Anglia)
- siarczan dodecylu sodu (SDS)
-                                              (Tween 20)
-
Fluka AG (Szwajcaria)
- bromocyjan
- N, N, N ',N ' - tetrametylenodiamina (TEMED)
- odczynnik Folina - Ciocalteau
- trihydroksymetyloaminometan (TRIS)
Pharmacia Fine Chemicals (Szwecja)
- Sefadeks G-25
- Sefaroza 4B
- Ultrogel AcA 44
Serva Feinbiochemica (Niemcy)
-                                   (Triton X-100)
- b³êkit kumazyny R-250
- fluorek fenylometylosulfonowy (PMSF)
- trypsyna
- papaina
- cytochrom C (koñski)
- mioglobina (koñska)

Sigma Chemical Company (USA)
- eter N, N, N ', N' - tetraacetylo-bis-(-aminoetylowy) glikolu etylenowego (EGTA) 
-                                                   (E-64)                                                  
- aprotynina
- lizyna
- diaminobenzydyna (DAB)
Dako AG
- ABC Kit

Preparacja hemoglobiny
	Materia³em wyjœciowym do preperacji hemoglobin ludzkiej, szczurzej i œwiñskiej by³a krew pe³na pobrana na heparynê (100 J/ml).  Bia³ka osocza odmywano roztworem soli fizjologicznej przez wirowanie przy 2 500 g przez 15 min. Uzyskane erytrocyty lizowano w trzech objêtoœciach wody destylowanej przez 1 godzinê. Stromê usuwano przez wirowanie przy 15 000 g przez 1 godzine. Klarowny supernatant zageszczano przez ultrafiltracjê na aparacie Amikon z u¿yciem membrany PM - 10 i poddawano filtracji ¿elowej na kolumnie z AcA 44 zrównowa¿onej roztworem PBS, pH 7.4. Frakcje zawieraj¹ce hemoglobinê zlewano i przechowywano w porcjach w -20 C. Wszystkie czynnoœci przeprowadzano w temperaturze 4 C. Czystoœæ bia³ek sprawdzano w elektroforezie w ¿elu poliakryloamidowym w obecnoœci siarczanu dodecylu sodu [ ]. Koñcowe ste¿enie hemoglobiny w preparacie oznaczano metod¹ cyanomethemoglobinow¹ [ ] i Bradforda [ ]. Wyniki uzyskiwane obiema metodami by³y podobne.

Preparacja apohemoglobiny
	Apohemoglobinê otrzymano przez ekstrakcje hemu z hemoglobiny w uk³adzie HCl/aceton  w –20 C metod¹ Rossi-Fanelli jak opisano w [ ].  2% roztwór hemoglobiny w wodzie wkrapiano powoli do 30 objetoœci mieszaniny aceton – 2M HCl (300 : 1) o temperaturze –20 C przy intensywnym mieszaniu. Roztwór pozostawiono na mieszadle przez 0,5 godz. Osad uzyskany przez wirowanie przy 3 500 g rozpuszczano w kolejnej porcji roztworu ekstrahuj¹cego i postepowano jak poprzednio. Koñcowy osad rozpuszczono w niewielkiej iloœci wody i dializowano w 4 C najpierw do roztworu NaHCO3 (50 mg/L) a nastepnie do wody. Wydializowany roztwór liofilizowano.

Znakowanie hemoglobiny 125J.
	W celu unikniêcia zmian oksydacyjnych hemoglobinê znakowano poprzez grupy aminowe za pomoc¹ odczynnika Boltona-Huntera wed³ug procedury opisanej przez Franzena i wsp. [ ] 20 ul odczynnika Boltona Huntera w benzenie o akywnoœci 5 mCi/ml odpipetowywano do polipropylenowej sto¿kowej probówki i odparowywano azotem. Do probówki dodawano 50 uL Hb wydializowanej do 0,1 M buforu boranowego, pH 8,5 i pozostawiano w 4 C przez 0,5 godz. Po tym czasie dodawano 20 uL 0,25 M glicyny i roztwór inkubowano przez 1 godz w tej samej temperaturze. Znakowan¹ Hb oddzielano od niezwi¹zanego odczynnika boltona huntera przez filtracjê ¿elow¹ na kolumnie z sefadeksem G-25 zrównowazonej TBS. Frakcje o najwy¿szej aktywnoœci zlewano, mierzono stê¿enie bialka metod¹ Bradforda i radioaktywnoœæ. Aktywnoœci specyficzne uzyskanych preparatów wynosi³y od 0,05 do 0,1 uCi/ug bia³ka.

Preparacja kory nerki szczura
Szczury usypiano przez podanie pentobarbitalu sodu (50 mg/kg wagi cia³a) W celu zapobie¿enia zakrzepom krwi podczas perfuzji szczurom podawano do¿ylnie heparynê (    ) Nerki perfundowano przez aortê brzuszn¹ roztworem PBS pH 7.4 zawieraj¹cym heparyne (     ) o temperaturze 37 C a¿ do ca³kowitego wyp³ukania krwi. Wyciête nerki umieszczano w zimnym  (4 C) roztworze do perfuzji. Nerki rozpo³awieno za pomoc¹ ¿yletki, usuwano b³onê zewnêtrzn¹ i wycinano czeœæ korow¹. Tak uzyskany materia³ zamrazano w mieszaninie suchy lód/aceton i przechowywano w –80 C.

Preperacja membran r¹bka szczoteczkowego nerek szczura
 Membrany rabka szczoteczkowego nerki szczura preparowano metod¹ Malathi i wsp. [ ]. 
	Wszystkie czynnoœci wykonywano w temperaturze 4 C. Czêœci korowe nerek rozmra¿ano w 5 objêtosciach buforu homogenizacyjnego (2 mM Tris/HCl, pH 7.0, 50 mM mannitol) i homogenizowano w homogenizatorze no¿owym (3 x 30 sek ). Do homogenatu przes¹czonego przez dwie warstwy gazy dodawano 1 M MgCl2 do koñcowego stê¿enia 10 mM i pozostawiano na mieszadle przez 10 min. Homogenat wirowano przy 3000 g przez 15 min. Osad zawieraj¹cy b³ony retikulum endoplazmatycznego i mitochondrillne odrzucano. Uzyskany supernatant wirowano przy 50 000 g. Osad membran plazmatycznych rozprowadzano w buforze homogenizacyjnym i ponownie wirowano w tych samych warunkach. Uzyskany osad rozprowadzano w niewielkiej iloœci 50 mM Tris/HCl, pH 7.4. Po oznaczeniu  ste¿enia bia³ka metod¹ Bradforda [ ] preparat rozcieñczano tym samym buforem do ste¿enia 5 mg/ml, zamra¿ano w 0,5 ml porcjach w mieszaninie suchy lód aceton i przechowywano w -80 C. W próbkach homogenatu i frakcji membranowej oznaczano aktywnoœæ alkalicznj fosfatazy - enzymu markerowago membran r¹bka szczoteczkowego - metod¹                     [ ]. Stopieñ zagêszczenia tego enzymu w uzyskanych preparatach waha³ siê od 6.8 do 7.2.
 
Przygotowanie skrawków parafinowych nerek
	Przed pobraniem materia³u szczury poddawano dekapitacji i skrwawiano. Uzyskane nerki ciêto na ma³e bloczki, utrwalano w 2 % paraformaldehydzie przez 72 godziny i zatapiano w parafinie wed³ug standardowej procedury.

Badania Immunocytochemiczne
	Po odparafinowaniu, skrawki nerek traktowano 1 % H2O2  przez  30 min w celu zahamowania endogennej aktywnoœci peroksydazowej, p³ukano w wodzie destylowanej i preinkubowano z 0,5 % albumin¹ wo³ow¹ aby zablokowaæ niespecyficzne miejsca wi¹¿ace. Tak przygotowane skrawki poddawano kolejnym inkubacjom z: hemoglobin¹ szczura, (0.01-10 ug/ml) przez 1 godzinê,  surowic¹ królicz¹ skierowan¹ przeciwko hemoglobinie szczura (1:200) przez 1 godzinê oraz z biotynylowanym przeciwcia³om monokolonalnym  skierowanym przeciwko króliczym IgG i kompleksem streptawidyna-peroksydaza zgodnie z zaleceniem producenta (ABC - Kit; Dako, Glostrup, Dania). W celu dalszego wzmocnienia reakcji skrawki inkubowano z biotynylowan¹ tyramin¹ w obecnoœci H2O2 i kompleksem streptawidyna - peroksydaza wed³ug metody ImmunoMax [X,X] Reakcje barwn¹ wywo³ywano 0,1 % roztworem diaminobenzydyny w 0,05 M Tris/HCl, pH 7,6. W Skrawki kontrolne poddawano tekiej samej procedurze ale nie inkubowano ich z hemoglobin¹. Kompetycjê wi¹zania hemoglobiny i innych bia³ek sprawdzano inkubuj¹c skrawki z roztworem zawieraj¹cym hemoglobninê i 100 - krotny molowy nadmiar jednego z nastêpujacych bia³ek: sojowego inhibitora trypsyny, lizozymu bia³ka jaja kurzego, albuminy wo³owej, cytochromu c konia, mioglobiny konia, hemoglobiny œwini i hemoglobiny ludzkiej. Zwi¹zan¹ hemoglobinê wykrywano tak jak wy¿ej. Surowice odpornoœciowe i bia³ka rozcieñczano do odpowiedniego ste¿enia roztworem PBS, pH 7,4, zawieraj¹cym 0,05 % Tween 20. 

Wi¹zanie hemoglobiny do membran r¹baka szczoteczkowego nerki szcura
Sta³a dysocjacji i maksymalna iloœæ miejsc wi¹¿¹cych
Wi¹zanie 125J Hb do membran r¹bka szczoteczkowego nerki szczura badano technik¹ szybkiej filtracji w temperaturze 4 C. Do probówk odpipetowywano po 20 uL preparatu membran (100 ug bia³ka),  100 uL znakowanej Hb ( ~ 10 4 cpm), nieznakowan¹ Hb (0 – 60 umoli ) odpowiednie iloœci buforu wiazania (0,05 M Tris/HCl, 0,138 M NaCl, 0,0027 M KCl, pH 7,4 - TBS) do koñcowej objetoœci 200 uL. Po 1 godz inkubacji 150 uL próbki nanoszono na s¹czki GVWP 0,22 um (Millipore, USA) i przep³ukiwano 5 ml buforu wiazania w celu usuniêcia niezwi¹zanego ligandu. Radioaktywnoœæ s¹czków  odzwierciedlaj¹c¹ iloœc zwi¹zanego przez membrany ligandu mierzono za pomoc¹ licznika promieniowania gamma (Polon, Polska). Wi¹zanie niespesyficzne okreœlano na podstawie prób zawierajacych 100 -  krotnie wieksze ste¿enie zimnego ligandu ni¿ obserwowane wartoœci sta³ej dysocjacji (Kd) Kd i maksymaln¹ iloœæ miejsc wi¹¿acych  okreœlano metod¹ Schacharda [ ].
Asocjacja i dysocjacja
W badaniach ascocjacji znakowan¹ Hb (10 4 cpm) dodawano do mieszaniny zawieraj¹cej membrany i bufor wi¹zania w czasie 0. Mieszaninê inkubacyjn¹ próbkowano po 0,5 do 60 min. Dysocjacjê badano przez dodanie w czasie 0 nieznakowanej hemoglobiny (koñcowe stêzenie 100 uM) do membran inkubowanych ze znakowan¹ Hb (10 4 cpm) przez 60 min. Mieszaninê  próbkowano tak jak w badaniach asocjacjii. Ilosæ zwi¹zanego ligandu okreslano jak wy¿ej.
Specyficznoœæ
Specyficznoœci wi¹zania  Hb do membran badano poprzez inkubacjê membran ze znakowan¹ Hb w obecnoœci nastepujacych bia³ek: apohemoglobiny (0 – 200 uM) albuminy wo³owej (0-200 uM), mioglobiny (0-200 uM), cytychromu C (200 uM), aprotyniny (200 uM) oraz lizyny (200 uM).
Wp³yw Ca++ na wi¹znie 
Wp³yw Ca++ na wi¹zanie Hb do membran badano przez inkubacjê membran ze znakowan¹ Hb w obecnoœci ró¿nych buforów wi¹zania: bufuru bez Ca++ (TBS), buforu z Ca++ (TBS, 4 mM CaCl2), buforu z EGTA (TBS, 4 mM Na2EDTA).
Wrazliwoœc czynnika wi¹¿acego na peptydazy
Wrazliwoœc czynnika wi¹¿acego na peptydazy badano poprzez inkubacjê zanakowanej Hb z membranami poddanymi preinkubacji z 0,1 % trypsyn¹ i 0,1 % papain¹. Do próbek kontrolnych dodawano membrany preinkubowane 0,1 % trypsyn¹ i 0,1 % papain¹ w obecnosci odpowiednio 1 mM PMSF i 1 mM E-64.
Wp³yw pH na wi¹zanie
Wp³yw pH na wi¹zanie badano poprzez inkubacjê membran ze znakowan¹ Hb w buforach 0.15 M weronal sodu - octan sodu oraz 0,15 M NaHPO4 - KH2PO4 o pH od 5,4 do 7,4.

Chromatografia powinowactwa bia³ek membranowych na Hb-Sefarozie 4B

Ekstrakcja bia³ek membranowych za pomoc¹ CHAPS.
Do 15 ml zawiesiny membran (10 mg bia³ka /ml) dodawano 5 ml 8 % CHAPS w 50 mM tris/HCL, pH 7.4,        PMSF, sonikowano 3 razy po 30 sek w p³uczce ultradŸwiêkowej i mieszano przez 30 min w 4 C. Nierozpuszczony materia³ usuwano przez ultrawirowanie przy 100 000 g. Supernatant dializowano przez noc do 0,1 % CHAPS w 50 mM Tris/HCl, pH 7,4,        XXXXXX PMSF.
Sprzêganie Hb z Sefaroz¹ 4B.
Sefarozê 4B aktywowano za pomoc¹ bromocyjanu wed³ug Marcha i wsp. [ ]. Hemoglobinê wi¹zano do zaktywowanego ¿elu w warunkach opisanych przez Dalwersa i wsp. [ ]. Iloœæ 
Chromatografia powinowactwa
Przed u¿yciem kolumnê 

Rothgeb M, Gurd R. (1978) Physical methods for the study of myoglobin. Meth. Enzymol., 52, 473-486.Frantzen F, Heggli D, Sundrehagen E (1995) radiolabelling of human haemoglobin using the 125I-Bolton-Hunter reagent is superior to oxidative iodination for conservation of the native structure of labelled protein. Bioechnol. Appl. Biochem., 22, 161-167.